Cereal/legume rotation effects on rhizosphere bacterial community structure in West African soils

The increased use of cereal/legume crop rotation has been advocated as a strategy to increase cereal yields of subsistence farmers in West Africa, and is believed to promote changes in the rhizosphere that enhance early plant growth. In this study we investigated the microbial diversity of the rhizoplane from seedlings grown in two soils previously planted to cereal or legume from experimental plots in Gaya, Niger, and Kaboli, Togo. Soils from these legume rotation and continuous cereal plots were placed into containers and sown in a growth chamber with maize (Zea mays L.), millet (Pennisetum glaucum L.), sorghum (Sorghum bicolor L. Moench.), cowpea (Vigna unguiculata L.) or groundnut (Arachis hypogaea L.). At 7 and 14 days after sowing, 16S rDNA profiles of the eubacterial and ammoniaoxidizing communities from the rhizoplane and bulk soil were generated using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Community profiles were subjected to peak fitting analyses to quantify the DNA band position and intensities, after which these data were compared using correspondence and principal components analysis. The data showed that cropping system had a highly significant effect on community structure (p <0.005), irrespective of plant species or sampling time. Continuous cereal-soil grown plants had highly similar rhizoplane communities across crop species and sites, whereas communities from the rotation soil showed greater variability and clustered with respect to plant species. Analyses of the ammonia-oxidizing communities provided no evidence of any effects of plant species or management history on ammonia oxidizers in soil from Kaboli, but there were large shifts with respect to this group of bacteria in soils from Gaya. The results of these analyses show that crop rotation can cause significant shifts in rhizosphere bacterial communities.

Bacterial ecology of ancient Saharan salt-enrichment ponds at Teguidda-n-Tessoumt

Little is known about the bacterial ecology of evaporative salt-mining sites (salterns) of which Teguidda-n-Tessoumt at the fringe of the West-African Saharan desert in Niger is a spectacular example with its many-centuries-old and very colorful evaporation ponds. During the different enrichment steps of the salt produced as a widely traded feed supplement for cattle, animal manure is added to the crude brine, which is then desiccated and repeatedly crystallized. This study describes the dominant Bacteria and Archaea communites in the brine from the evaporation ponds and the soil from the mine, which were determined by PCR-DGGE of 16S rDNA. Correspondence analysis of the DGGE-community fingerprints revealed a change in community structure of the brine samples during the sequential evaporation steps which was, however, unaffected by the brine's pH and electric conductivity (EC). The Archaea community was dominated by a phylogenetically diverse group of methanogens, while the Bacteria community was dominated by gamma proteobacteria. Microorganisms contained in the purified salt product have the potential to be broadly disseminated and are fed to livestock across the region. In this manner, the salt mines represent an intriguing example of long-term human activity that has contributed to the continual selection, cultivation, and dissemination of cosmopolitan microorganisms.

Charakterisierung der mikrobiellen Population und Untersuchungen zum Quorum Sensing in der Rhizosphäre vom Weidelgras (Lolium perenne) auf einer Rückstandshalde der Kaliindustrie

Im Rahmen dieser Dissertation wurden die Dynamik und die Kommunikation innerhalb der mikrobiellen Population der Rhizosphäre von Deutschem Weidelgras (Lolium perenne) untersucht, welches auf einer teilweise rekultivierten Rückstandshalde der Kaliindustrie wuchs. Um die niederschlagsbedingte Auswaschung von Salzen zu reduzieren, wird die Rückstandshalde des Kaliwerks Sigmundshall (in Bokeloh bei Hannover) schrittweise mit dem technogenen Abdecksubstrat REKAL/SAV ummantelt. Dieses weist eine hohe Standfestigkeit und Wasserspeicherkapazität auf und kann zudem begrünt werden, wofür als Pionierpflanze Lolium perenne dient. Durch diese Rekultivierung wird Niederschlag besser gespeichert und über Evapotranspiration wieder in die Luft abgegeben, was letztendlich die Bildung von Salzwasser vermindert. Da das Abdecksubstrat neben alkalischem pH-Wert auch teilweise hohe Schwermetallkonzentrationen aufweist, sollte in der vorliegenden Arbeit erstmals die mikrobielle Rhizosphären-Gemeinschaft in diesem extremen Habitat mittels einer kulturunabhängigen Methode erforscht werden. Zudem wurden erste Untersuchungen angestellt, ob im Substrat die zelldichte-abhängige bakterielle Kommunikation (Quorum Sensing) nachgewiesen werden kann. Mittels extrahierter Gesamt-DNA wurde anhand der 16S rDNA die Analyse des „Terminalen Restriktonsfragmentlängenpolymorphismus“ (TRFLP) verwendet, um die komplexe bakterielle Rhizosphären-Gemeinschaft unter zeitlichen und lokalen Aspekten zu vergleichen. Auftretende Veränderungen bei den bakteriellen Populationen der jeweiligen Proben wurden durch eine Zu- oder Abnahme der auch als Ribotypen bezeichneten terminalen Restriktionsfragmente (TRF) erfasst. Hierbei zeigten sich am Südhang der Halde während der Sommermonate der Jahre 2008 und 2009 zwar Schwankungen in den bakteriellen Gemeinschaftsprofilen, es lagen jedoch keine eindeutigen Dynamiken vor. Im Vergleich zum Südhang der Halde wies der Nordhang eine höhere Ribotyp-Diversität auf, was mit der fortgeschritteneren Rekultivierung dieses Haldenabschnitts zusammenhängen könnte. Zusätzlich wurden Bakterien aus der Rhizosphäre von Lolium perenne isoliert und mithilfe der Biosensoren Agrobacterium tumefaciens A136 pCF218 pCF372 und Chromobacterium violaceum CV026 auf die Produktion von N-Acylhomoserinlactonen (AHLs) überprüft. Diese AHLs werden von Gram-negativen Mikroorganismen als Signalmoleküle verwendet, um ihre Genexpression zelldichteabhängig zu kontrollieren. Von den 47 getesteten Gram-negativen Rhizosphärenisolaten konnten nur bei einem reproduzierbar AHL-Moleküle mithilfe des Reporterstamms A. tumefaciens nachgewiesen werden. Der AHL-Produzent wurde als Pseudomonas fluorescens identifiziert. Mittels dünnschichtchromatographischer Analysen konnten die extrahierten bakteriellen AHL-Moleküle den N-Octanoyl-L-homoserinlactonen zugeordnet werden.

Vom Biofilm zur planktonischen Lebensform

Im ersten Teil dieser Dissertation stand die Analyse der Motilitätsentwicklung bei Vertretern der Gattung Methylobacterium im Vordergrund. Diese zu den pink pigmentierten fakultativ methylotrophen Mikroorganismen (PPFMs) gehörenden Prokaryoten sind in der Umwelt weit verbreitet. Besonders häufig besiedeln die Mikroben pflanzliche Oberflächen und können als so genannte Phytosymbionten in einer wechselseitigen Beziehung zu pflanzlichen Organismen stehen. In aquatischer Umgebung können Methylobakterien Flagellen aufweisen. Hierbei handelt es sich um spezielle Fortbewegungsorganellen, die den Mikroben eine aktive Beweglichkeit ermöglichen. Die Ausbildung polarer Einzelflagellen bei Methylobacterium-Zellen in planktonischer Lebensweise konnte unter Anwendung verschiedener mikroskopischer Techniken dokumentiert werden. Quantitative Beweglichkeitsstudien zeigten einen charakteristischen Entwicklungsverlauf, korreliert mit den Wachstumsphasen der Bakterienkulturen und machten deutlich, dass die Motilitätsrate durch Umweltfaktoren, wie z. B. die Nährstoffversorgung, beeinflusst werden kann. Es konnte gezeigt werden, dass die Pflanzen-assoziierten PPFMs in der Lage sind, zwischen einer sessilen und planktonischen Lebensweise zu wechseln und dass sowohl die zelluläre Beweglichkeit als auch die Biofilm-Bildung der Prokaryoten ein reversibles, reaktivierbares Verhalten darstellt. Weiterhin konnte belegt werden, dass die Motilität der epiphytischen Mikroben bezüglich der Besiedelung von Pflanzen, z. B. bei der Ausbreitung auf Keimblatt-Oberflächen von Sonnenblumen (Helianthus annuus), keine zentrale Rolle spielt und eine endophytische Lebensweise unwahrscheinlich ist. Ziel der Arbeit war weiterhin die Charakterisierung und Identifizierung eines aus der Phyllosphäre der Echten Feige (Ficus carica, Standort Griechenland) isolierten Bakterien-Stammes (Mtb. sp. Fc1). Die fakultativ methylotrophe Stoffwechseleigenschaft, sowie die auffällige rötliche Pigmentierung belegen, dass es sich um einen Vertreter der PPFMs handelt. Die Analyse morphologischer, physiologischer und biochemischer Eigenschaften bestätigte in Übereinstimmung mit molekularphylogenetischen Untersuchungen zur Klassifizierung und taxonomischen Einordnung, dass es sich um Pflanzen-assoziierte Mikroben der Gattung Methylobacterium handelt. Analysen der 16S rDNA sowie partieller Sequenzen der für Methylobakterien etablierten Marker-Gene mxaF und gyrB verdeutlichten die phylogenetische Stellung und die evolutionären Beziehungen des Ficus-Isolates. Obwohl enge Verwandtschaftsverhältnisse zu anderen Methylobacterium-Arten ermittelt werden konnten, war eine Identifizierung als valide beschriebene Spezies nicht möglich. Die Resultate legen den Schluss nahe, dass es sich um eine neue, unbeschriebene Spezies der epiphytisch lebenden Methylobakterien handelt.

Nuclear organisation and epigenetic regulation of gene expression in Dictyostelium discoideum

A series of vectors for the over-expression of tagged proteins in Dictyostelium were designed, constructed and tested. These vectors allow the addition of an N- or C-terminal tag (GFP, RFP, 3xFLAG, 3xHA, 6xMYC and TAP) with an optimized polylinker sequence and no additional amino acid residues at the N or C terminus. Different selectable markers (Blasticidin and gentamicin) are available as well as an extra chromosomal version; these allow copy number and thus expression level to be controlled, as well as allowing for more options with regard to complementation, co- and super-transformation. Finally, the vectors share standardized cloning sites, allowing a gene of interest to be easily transfered between the different versions of the vectors as experimental requirements evolve. The organisation and dynamics of the Dictyostelium nucleus during the cell cycle was investigated. The centromeric histone H3 (CenH3) variant serves to target the kinetochore to the centromeres and thus ensures correct chromosome segregation during mitosis and meiosis. A number of Dictyostelium histone H3-domain containing proteins as GFP-tagged fusions were expressed and it was found that one of them functions as CenH3 in this species. Like CenH3 from some other species, Dictyostelium CenH3 has an extended N-terminal domain with no similarity to any other known proteins. The targeting domain, comprising α-helix 2 and loop 1 of the histone fold is required for targeting CenH3 to centromeres. Compared to the targeting domain of other known and putative CenH3 species, Dictyostelium CenH3 has a shorter loop 1 region. The localisation of a variety of histone modifications and histone modifying enzymes was examined. Using fluorescence in situ hybridisation (FISH) and CenH3 chromatin-immunoprecipitation (ChIP) it was shown that the six telocentric centromeres contain all of the DIRS-1 and most of the DDT-A and skipper transposons. During interphase the centromeres remain attached to the centrosome resulting in a single CenH3 cluster which also contains the putative histone H3K9 methyltransferase SuvA, H3K9me3 and HP1 (heterochromatin protein 1). Except for the centromere cluster and a number of small foci at the nuclear periphery opposite the centromeres, the rest of the nucleus is largely devoid of transposons and heterochromatin associated histone modifications. At least some of the small foci correspond to the distal telomeres, suggesting that the chromosomes are organised in a Rabl-like manner. It was found that in contrast to metazoans, loading of CenH3 onto Dictyostelium centromeres occurs in late G2 phase. Transformation of Dictyostelium with vectors carrying the G418 resistance cassette typically results in the vector integrating into the genome in one or a few tandem arrays of approximately a hundred copies. In contrast, plasmids containing a Blasticidin resistance cassette integrate as single or a few copies. The behaviour of transgenes in the nucleus was examined by FISH, and it was found that low copy transgenes show apparently random distribution within the nucleus, while transgenes with more than approximately 10 copies cluster at or immediately adjacent to the centromeres in interphase cells regardless of the actual integration site along the chromosome. During mitosis the transgenes show centromere-like behaviour, and ChIP experiments show that transgenes contain the heterochromatin marker H3K9me2 and the centromeric histone variant H3v1. This clustering, and centromere-like behaviour was not observed on extrachromosomal transgenes, nor on a line where the transgene had integrated into the extrachromosomal rDNA palindrome. This suggests that it is the repetitive nature of the transgenes that causes the centromere-like behaviour. A Dictyostelium homolog of DET1, a protein largely restricted to multicellular eukaryotes where it has a role in developmental regulation was identified. As in other species Dictyostelium DET1 is nuclear localised. In ChIP experiments DET1 was found to bind the promoters of a number of developmentally regulated loci. In contrast to other species where it is an essential protein, loss of DET1 is not lethal in Dictyostelium, although viability is greatly reduced. Loss of DET1 results in delayed and abnormal development with enlarged aggregation territories. Mutant slugs displayed apparent cell type patterning with a bias towards pre-stalk cell types.